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實時熒光定量ＰＣＲ儀百科知識
１． 定義與概述
實時熒光定量ＰＣＲ儀（Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ， ｑＰＣＲ）是一種基于聚合酶鏈式反應（ＰＣＲ）技術，通過熒光信號實時監測ＤＮＡ擴增過程的高精度分子生物學儀器。
核心功能：
定量檢測ＤＮＡ／ＲＮＡ的初始模板量（絕對定量或相對定量）。
檢測基因表達水平、病原體載量、基因突變等。
廣泛應用于疾病診斷、基因研究、食品安全檢測等領域。
２． 核心技術原理
熒光標記機制：
ＴａｑＭａｎ探針法：探針帶有熒光基團和淬滅基團，擴增時探針水解釋放熒光。
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法：染料嵌入雙鏈ＤＮＡ發出熒光，成本低但特異性稍差。
分子信標（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）：莖環結構探針，靶序列結合后發光。
檢測模式：
終點法：僅檢測最終產物量。
實時法：通過Ｃｔ值（閾值循環數）動態分析擴增曲線，實現精準定量。
３． 核心參數與性能指標
| 參數 | 意義 | 典型范圍／要求 |
|---|---|---|
| 檢測通道數 | 支持多色熒光檢測能力（如ＦＡＭ， ＨＥＸ， ＲＯＸ） | １－６通道（多用于多重ＰＣＲ） |
| 靈敏度 | 最低可檢測ＤＮＡ拷貝數 | 單拷貝（＜１０ ｃｏｐｉｅｓ／μＬ） |
| 溫控精度 | 溫度均一性和升降溫速率 | ±０．１°Ｃ，升降溫≥４°Ｃ／秒 |
| 動態范圍 | 線性定量范圍（Ｌｏｇ值） | ７－８個數量級（１０＾１～１０＾８拷貝） |
４． 主要應用場景
臨床診斷：
病毒／細菌核酸檢測（如新冠病毒、ＨＰＶ、結核分枝桿菌）。
腫瘤基因突變檢測（ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ等）。
科研領域：
基因表達分析（ｍＲＮＡ定量）。
ｍｉＲＮＡ檢測、ＳＮＰ分型。
農業與食品：
轉基因成分鑒定。
食源性致病菌（如沙門氏菌）快速檢測。
５． 與傳統ＰＣＲ的對比
| 特性 | 實時熒光定量ＰＣＲ | 傳統ＰＣＲ |
|---|---|---|
| 定量能力 | 實時監測，精準定量（基于Ｃｔ值） | 僅終點定性／半定量（電泳分析） |
| 檢測速度 | １－２小時（含數據分析） | ２小時＋額外電泳時間 |
| 污染風險 | 閉管操作，污染風險低 | 開蓋電泳，易污染 |
| 成本 | 較高（熒光試劑／探針） | 低 |
６． 操作流程與注意事項
標準流程：
樣本制備：提取ＤＮＡ／ＲＮＡ并反轉錄為ｃＤＮＡ（ＲＮＡ檢測時）。
反應體系配制：加入引物、探針、模板、Ｔａｑ酶等。
程序設置：設定擴增程序（預變性→循環擴增→熔解曲線分析）。
數據分析：通過軟件計算Ｃｔ值，生成標準曲線或相對表達量。
關鍵注意事項：
避免ＲＮＡ降解（使用ＲＮａｓｅ抑制劑）。
防止交叉污染（分區操作、ＵＮＧ酶防殘留）。
驗證引物特異性（熔解曲線單峰）。
７． 主流品牌與型號
| 品牌 | 代表型號 | 特點 |
|---|---|---|
| Ｂｉｏ－Ｒａｄ | ＣＦＸ９６ | 高性價比，５通道檢測，適合中小型實驗室 |
| Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ | ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ | 模塊化設計，支持高通量（３８４孔板） |
| Ｒｏｃｈｅ | ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ | 超快升降溫（１９°Ｃ／秒），精準溫控 |
| Ｑｉａｇｅｎ | Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ | 離心式溫控，均一性好，適合低濃度樣本 |
８． 未來發展趨勢
數字化ＰＣＲ（ｄＰＣＲ）：通過微滴分區實現絕對定量，無需標準曲線。
便攜化設備：手持式ｑＰＣＲ儀（如ＢｉｏＦｉｒｅ ＦｉｌｍＡｒｒａｙ）用于床邊檢測。
ＡＩ整合：自動優化引物設計、智能分析擴增異常曲線。
多重檢測升級：支持１０＋靶標同步檢測（如病原體ｐａｎｅｌ篩查）。
９． 常見問題（ＦＡＱ）
Ｑ：是否必須做標準曲線？
Ａ：絕對定量需要標準品繪制曲線；相對定量（如２＾－ΔΔＣｔ法）可不依賴標準曲線。Ｑ：熔解曲線出現多峰怎么辦？
Ａ：可能為引物二聚體或非特異擴增，需優化引物濃度或退火溫度。Ｑ：如何提高低濃度樣本的檢測靈敏度？
Ａ：增加模板體積、使用高靈敏度探針（如ＴａｑＭａｎ ＭＧＢ）、減少抑制劑干擾。
總結
實時熒光定量ＰＣＲ儀憑借高靈敏度、快速定量、閉管防污染等優勢，已成為分子診斷和基因研究的核心技術平臺。隨著數字化、微流控等技術的融合，其在精準醫學和即時檢測（ＰＯＣＴ）中的應用將更加廣泛。
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