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實時熒光定量ＰＣＲ分析儀
定義
實時熒光定量ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ，ｑＰＣＲ）分析儀是一種用于在ＤＮＡ擴增過程中實時監(jiān)測熒光信號的高精度分子生物學儀器。它結(jié)合了傳統(tǒng)ＰＣＲ的核酸擴增能力與熒光檢測技術(shù)，可對起始模板ＤＮＡ／ＲＮＡ進行精確定量、基因表達分析、病原體檢測等，是分子診斷、基因研究的核心設(shè)備。
核心工作原理
ＰＣＲ擴增基礎(chǔ)
通過溫度循環(huán)（變性→退火→延伸）在體外指數(shù)級擴增特定ＤＮＡ片段。
熒光標記與檢測
熒光探針／染料：在反應(yīng)體系中加入熒光標記物（如ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、ＴａｑＭａｎ探針），其熒光強度與ＰＣＲ產(chǎn)物量成正比。
實時監(jiān)測：每完成一次擴增循環(huán)，儀器通過光學系統(tǒng)檢測熒光信號，生成擴增曲線。
定量原理
Ｃｔ值（循環(huán)閾值）：熒光信號達到設(shè)定閾值時的循環(huán)數(shù)。Ｃｔ值與起始模板量成反比（模板越多，Ｃｔ值越小）。
標準曲線法：通過已知濃度的標準品建立Ｃｔ值－濃度對數(shù)曲線，計算未知樣本濃度。
儀器核心結(jié)構(gòu)
| 組件 | 功能 |
|---|---|
| 熱循環(huán)模塊 | 精確控制溫度（±０．１℃），實現(xiàn)快速升降溫（可達６℃／秒）。 |
| 光學檢測系統(tǒng) | 多通道熒光檢測器（常見４－６色），激發(fā)／發(fā)射濾光片切換，采集熒光信號。 |
| 反應(yīng)模塊 | ９６孔／３８４孔反應(yīng)板，兼容多種耗材（如０．２ｍＬ管、多聯(lián)管）。 |
| 控制系統(tǒng) | 軟件驅(qū)動：設(shè)置程序（溫度、時間）、熒光通道、數(shù)據(jù)采集頻率。 |
| 數(shù)據(jù)分析軟件 | 自動計算Ｃｔ值、基因表達量（ΔΔＣｔ法）、熔解曲線分析、生成標準曲線等。 |
關(guān)鍵技術(shù)類型
熒光化學方法
莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針，僅與靶序列結(jié)合時發(fā)熒光，背景噪音低。
探針含報告／淬滅基團，擴增時水解釋放熒光，特異性極高。
結(jié)合雙鏈ＤＮＡ發(fā)熒光，成本低，但可能結(jié)合非特異產(chǎn)物（需熔解曲線驗證）。
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ：
水解探針（ＴａｑＭａｎ）：
分子信標（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）：
多重檢測能力
多色熒光通道可同時檢測多個靶基因（如病原體分型、內(nèi)參基因校正）。
核心應(yīng)用領(lǐng)域
| 領(lǐng)域 | 應(yīng)用場景 |
|---|---|
| 病原體檢測 | 病毒（如ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＨＩＶ）、細菌、真菌的快速定量診斷。 |
| 基因表達分析 | ｍＲＮＡ表達量測定（比較不同組織／藥物處理下的基因差異）。 |
| 基因分型與突變檢測 | ＳＮＰ分型、基因編輯（ＣＲＩＳＰＲ）效率驗證、癌癥驅(qū)動突變篩查。 |
| 轉(zhuǎn)基因檢測 | 食品／作物中轉(zhuǎn)基因成分定量。 |
| ｍｉｃｒｏＲＮＡ研究 | 短鏈ＲＮＡ定量（需特殊逆轉(zhuǎn)錄步驟）。 |
| 藥物研發(fā) | 藥效基因靶點表達調(diào)控分析。 |
操作流程
樣本準備：提取ＤＮＡ／ＲＮＡ → 逆轉(zhuǎn)錄（ＲＮＡ樣本）。
反應(yīng)體系配制：引物／探針、熒光染料、模板、聚合酶混合。
程序設(shè)置：
預變性（９５℃， ３０ｓ）→ 循環(huán)擴增（９５℃變性， ５ｓ → ６０℃退火／延伸， ３０ｓ， ４０次）→ 熔解曲線分析（６０℃→９５℃）。
數(shù)據(jù)分析：
軟件自動生成擴增曲線、熔解曲線、標準曲線，計算基因相對表達量（２＜ｓｕｐ＞－ΔΔＣｔ＜／ｓｕｐ＞）。
優(yōu)勢與局限
| 優(yōu)勢 | 局限性 |
|---|---|
| 高靈敏度（可檢測單拷貝基因） | 易受抑制劑影響（血色素、肝素等） |
| 寬動態(tài)范圍（跨越７－１０個數(shù)量級） | 引物／探針設(shè)計不當易導致假陰性 |
| 閉管操作，污染風險低 | 設(shè)備與試劑成本較高 |
| 快速（１－２小時完成檢測） | 需嚴格防ＲＮＡ降解（基因表達分析時） |
| 支持絕對定量與相對定量 | 依賴標準曲線（絕對定量需標準品） |
關(guān)鍵性能參數(shù)
溫控精度：±０．１℃（確保擴增特異性）。
檢測通道數(shù)：決定多重檢測能力（常見４－６通道）。
升降溫速率：＞５℃／秒可縮短反應(yīng)時間。
靈敏度：可檢測低至１－１０拷貝的模板。
通量：９６孔板（中通量）ｖｓ． ３８４孔板（高通量）。
發(fā)展趨勢
數(shù)字化ＰＣＲ（ｄＰＣＲ）：
將樣本分割為微滴，實現(xiàn)絕對定量無需標準曲線，精度更高。
便攜式ｑＰＣＲ儀：
現(xiàn)場快速檢測（如機場、田間病原體篩查）。
自動化整合：
與核酸提取儀、液體處理工作站聯(lián)用，全流程無人操作。
多重檢測升級：
１６色以上通道，單次檢測數(shù)十種靶標。
使用注意事項
防污染措施：
分區(qū)操作（試劑準備區(qū)→樣本處理區(qū)→擴增區(qū)），使用ＵＮＧ酶防殘留污染。
質(zhì)控設(shè)置：
陰性對照（無模板）、陽性對照、內(nèi)參基因（如ＧＡＰＤＨ）。
熔解曲線驗證（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法）：
確保擴增產(chǎn)物單一，無非特異峰。
總結(jié)
實時熒光定量ＰＣＲ分析儀憑借其高靈敏度、定量準確性和操作便捷性，已成為分子診斷與生命科學研究的基石設(shè)備。從新冠疫情中的病毒載量監(jiān)測，到癌癥基因的精準分型，其應(yīng)用深度持續(xù)拓展。隨著數(shù)字化、便攜化與自動化技術(shù)的融合，ｑＰＣＲ技術(shù)將繼續(xù)推動精準醫(yī)療與即時檢測的發(fā)展。
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