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定義
實時熒光ＰＣＲ分析儀是一種將傳統ＰＣＲ擴增與熒光信號檢測同步進行的高精度分子生物學設備。通過在ＰＣＲ反應體系中加入熒光標記物（探針或染料），實時監測擴增過程中熒光強度的變化，實現對目標核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）的定量（絕對／相對）或定性分析，無需后期電泳檢測。
核心原理
ＰＣＲ擴增基礎
遵循聚合酶鏈式反應（ＰＣＲ）三步驟：變性（高溫解鏈ＤＮＡ）、退火（引物結合模板）、延伸（合成新鏈）。
熒光信號生成
ＴａｑＭａｎ探針：５＇端報告基團（ＦＡＭ），３＇端淬滅基團（ＴＡＭＲＡ），水解后釋放熒光。
分子信標：莖環結構，結合靶序列后發夾打開，熒光恢復。
雙雜交探針：相鄰探針發生ＦＲＥＴ能量轉移產生熒光。
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ等染料嵌入雙鏈ＤＮＡ，發射熒光（強度與產物量成正比）。
缺點：易受非特異產物干擾。
熒光染料法（非特異性）：
熒光探針法（特異性）：
實時監測
每輪循環結束時檢測熒光強度，生成擴增曲線。
閾值線（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）：背景熒光以上的設定值，與Ｃｔ值相關。
Ｃｔ值（Ｃｙｃｌｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）：熒光強度達到閾值時的循環數，與起始模板量負相關（定量依據）。
核心組件
| 組件 | 功能 |
|---|---|
| 熱循環模塊 | 精確控制溫度（±０．１℃），實現變性、退火、延伸的快速切換。 |
| 光學檢測系統 | － 光源：ＬＥＤ、鹵鎢燈或激光器 － 濾光片／光柵：選擇激發／發射波長 － 檢測器：ＣＣＤ或ＰＭＴ捕獲熒光信號 |
| 多通道檢測 | 支持４－６色熒光通道（如ＦＡＭ， ＨＥＸ， ＲＯＸ， Ｃｙ５），實現多重檢測。 |
| 溫控技術 | － Ｐｅｌｔｉｅｒ半導體溫控：主流技術 － 離心式空氣加熱（快速ＰＣＲ儀） |
| 軟件與分析模塊 | 控制儀器運行，分析擴增曲線、計算Ｃｔ值、生成標準曲線、輸出定量／熔解曲線結果。 |
工作流程
樣本準備：提取核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ），構建反應體系（引物、探針、酶、ｄＮＴＰｓ）。
加樣：轉移至專用ＰＣＲ管或９６／３８４孔板。
程序設置：
溫度程序（預變性→循環擴增→延伸）
熒光通道選擇（根據染料／探針波長）
實時監測：每輪循環結束采集熒光信號。
數據分析：
定量分析：通過標準曲線計算模板拷貝數（絕對定量）或相對表達量（如２＜ｓｕｐ＞?ΔΔＣｔ＜／ｓｕｐ＞法）。
定性分析：熔解曲線分析（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法驗證產物特異性）。
陽性判定：Ｃｔ值≤預設閾值（通常３５－４０）。
關鍵性能參數
| 參數 | 意義 |
|---|---|
| 檢測靈敏度 | 最低可檢出模板量（可達單拷貝級別）。 |
| 動態范圍 | 可準確定量的濃度范圍（通常跨越６－８個數量級）。 |
| 分辨率 | 區分濃度差異的能力（如±１．５倍差異）。 |
| 通量 | 單次運行樣本數（９６孔／３８４孔板，高通量機型支持數千樣本／天）。 |
| 升溫／降溫速率 | 影響ＰＣＲ速度（常規儀器：３－５°Ｃ／秒；快速ＰＣＲ儀：＞１０°Ｃ／秒）。 |
| 多色檢測能力 | 支持同步檢測的熒光通道數（４－６通道為主）。 |
主要應用領域
病原體檢測
病毒（ＣＯＶＩＤ－１９、流感、ＨＩＶ）、細菌（結核分枝桿菌）、寄生蟲的快速診斷。
基因表達分析
ｍＲＮＡ定量（ｑＲＴ－ＰＣＲ），研究基因調控機制。
基因分型與突變檢測
ＳＮＰ分析、插入／缺失鑒定（探針法或熔解曲線分析）。
轉基因檢測
食品／作物中轉基因成分定量（如３５Ｓ啟動子、ＮＯＳ終止子）。
藥物開發與藥效評估
靶基因表達水平監測。
法醫學
ＤＮＡ指紋圖譜、親子鑒定。
優勢與局限性
| 優勢 | 局限性 |
|---|---|
| ? 高靈敏度與特異性 | ? 易受抑制劑影響（血色素、肝素等） |
| ? 閉管操作，降低污染風險 | ? 引物／探針設計難度高（尤其多重檢測） |
| ? 定量范圍廣，無需后期處理 | ? 設備及試劑成本較高 |
| ? 快速獲得結果（１－２小時） | ? 對實驗操作規范性要求嚴格 |
| ? 支持多重檢測（多靶標同步分析） | ? 絕對定量需標準品（增加復雜性） |
使用注意事項
防污染措施：
分區域操作（試劑準備區→樣本處理區→擴增區）。
使用帶濾芯吸頭、ＵＶ燈消毒工作臺。
質量控制：
設置陰性對照（無模板）、陽性對照、內參基因（如ＧＡＰＤＨ）。
探針／染料選擇：
多重檢測需避免光譜重疊。
ＲＮＡ檢測：
需逆轉錄步驟（ｑＲＴ－ＰＣＲ），嚴防ＲＮＡ酶污染。
發展趨勢
便攜化與現場檢測
手持式／床旁快速ＰＣＲ儀（如用于突發疫情現場篩查）。
自動化整合
與核酸提取儀、液體處理工作站聯用，構建全自動檢測線。
數字ＰＣＲ（ｄＰＣＲ）互補
提供絕對定量無需標準曲線，適用于低豐度靶標分析。
多重檢測能力提升
發展１０色以上熒光系統，實現超多重靶標同步檢測。
ＡＩ輔助分析
自動識別異常擴增曲線，優化結果判讀準確性。
代表廠商與機型
賽默飛世爾（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）：ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５／７， ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ
伯樂（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）：ＣＦＸ９６／３８４， ＣＦＸ Ｏｐｕｓ
羅氏（Ｒｏｃｈｅ）：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０／９６
安捷倫（Ａｇｉｌｅｎｔ）：ＡｒｉａＭｘ
國產平臺：宏石（ＳＬＡＮ）、博日（ＬｉｎｅＧｅｎｅ）
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